在之前的两期中，我们详细探讨了细胞转染和慢病毒转染的相关知识。本期将继续为大家介绍慢病毒转染的实验操作步骤、注意事项及常见问题，以帮助研究人员在应用中更为高效。

一、慢病毒实验步骤

慢病毒实验的主要步骤包括：质粒构建、病毒包装、病毒收集与浓缩、感染靶细胞，以及筛选与验证。具体如下：

1. 质粒构建

首先构建重组质粒，将外源目的基因片段插入质粒载体中，获得重组质粒，并在大肠杆菌中转化，接着提取得到重组质粒DNA。

2. 病毒包装

将重组质粒DNA与其他包装质粒按说明书比例共转染293T细胞，分别在48小时及72小时收获含病毒的上清。

3. 病毒收集与浓缩

将收集的含病毒上清以3000rpm离心20分钟，使用045um滤膜过滤以去除细胞沉淀。随后，将上清进行12000rpm离心以初步浓缩，然后分装并储存在-80°C。必要时可进行滴度测定。

4. 慢病毒转染细胞

在转染的第一天，以293T细胞为例，将状态良好的细胞消化收集后，调整细胞密度至1x10⁵个/mL，接种至24孔板，每孔添加0.5mL，混匀后放入37°C、5% CO₂培养箱中进行培养。不同细胞的生长速度不同，接种量应适当调整，通常要求在接种第二天感染时，细胞的汇合度在30%-50%。

第二天，观察293T细胞的生长情况，吸去旧的培养基，加入预热的新鲜完全培养液每孔0.25mL，再放入37°C、5% CO₂培养箱中培养4小时。同时留意控制有对照组不加病毒的孔。

第三天，转染后24小时，使用显微镜观察细胞状态，若无异常，则吸去含病毒的培养液，并补充新鲜完全培养液继续培养。

在第四至第六天，观察转染效果，若转染了荧光基团的慢病毒，可以在转染48小时后通过倒置荧光显微镜检测荧光强度，并在适宜浓度的puromycin或其他筛选药物中筛选成功转染的细胞。

二、慢病毒实验注意事项

在进行慢病毒实验时，需要注意以下几点：

• 病毒保存：病毒可在短期内4°C保存（不超过一周），长期需分装后在-80°C存放不超过6个月，使用时应避免反复冻融。
• 细胞状态：选择生长于对数期的活细胞进行转染，确保细胞活性良好以提高转染效率。
• 接种量：根据细胞生长速度和培养器皿的大小来设定接种量，通常在感染前细胞密度应保持在30%-50%。
• MOI值：通常MOI值越高，细胞的转染难度越大。需要提前计算细胞接种量和加病毒的体积。
• 文献查阅：实验前需查找相关文献资料，以优化转染实验条件。
• 细胞状态观察：需在转染前后观察细胞状态，如细胞状态不佳，暂缓筛选药物的使用。
• 观察转染效率的时间：通常在转染后48-72小时进行观察，根据细胞增殖速度调整观察时间。

三、实验常见问题

Q1: 如何提高慢病毒对细胞的感染效率？
影响感染效率的因素包括细胞状态、接种数量及MOI值，确保细胞状态良好，密度适中可提高感染效率。对于悬浮细胞，可采用离心感染的方法。

Q2: 转染后细胞死亡，如何处理？
确保细胞状态良好及感染条件适宜，避免因细胞不健康导致死亡。

Q3: 稳定转染与瞬时转染的区别？
无论瞬时还是稳定转染，DNA都会有一定概率整合到宿主染色体。稳定转染可通过药物筛选提供长期表达。

Q4: 慢病毒转染时，细胞接种量如何调整？
根据细胞增殖速度及培养皿大小设定接种量，以确保在感染后4天左右几乎覆盖培养皿底部。

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